农业土传病害（如青枯病、枯萎病、根腐病）严重制约作物产量与品质，传统化学防治易导致农药残留、土壤微生态破坏及病原菌抗药性演化。厌氧生防菌通过产生抗菌代谢物、竞争生态位、诱导植物系统抗性等机制防控土传病害，具有环境友好、可持续性强等优势，成为绿色农业的重要技术方向。

然而，厌氧生防菌对氧高度敏感，传统培养方法（如厌氧罐、Hungate 滚管）存在气体置换不彻底、环境波动大、操作繁琐等问题，导致活菌数低、代谢活性不稳定，难以满足工业化生产与田间大面积应用需求。博清生物科技（南京）有限公司研发的三气培养箱通过精确控制 O₂、CO₂、N₂浓度，结合恒温恒湿与无菌环境，为厌氧生防菌的高效培养提供了理想平台。

一、材料与方法

（一）实验材料

1、菌株：梭菌属Clostridium beijerinckii（分离自厌氧土壤灭菌处理土壤）、贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis IALR619。

2、培养基：强化梭菌培养基（RCM）、生防菌专用液体发酵培养基（配方：葡萄糖 10 g、蛋白胨 5 g、酵母粉 3 g、NaCl 5 g、K₂HPO₄ 1.5 g、MgSO₄・7H₂O 0.2 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0–7.2）

3、设备：博清生物三气培养箱（ZJS-160-J，容积160L，304不锈钢内胆，气体控制精度±0.1%，温度波动 ±0.2℃）；厌氧罐（对照）；高压蒸汽灭菌锅；超净工作台；分光光度计；菌落计数器

（二）实验方法

1、三气培养箱环境构建与验证

开机预热：启动三气培养箱，设定温度 30℃，湿度 95%，预运行 2 h，待参数稳定。

气体置换：通过控制系统通入 N₂、CO₂混合气体，设定 O₂浓度≤0.5%、CO₂ 5%–10%，重复抽气 - 充气循环 3 次，确保箱内氧浓度达标。

环境验证：放置厌氧指示剂（亚甲基蓝），30 min 后指示剂呈无色，证明厌氧环境构建成功。

2、厌氧生防菌复苏与增殖培养

菌种复苏：从 - 80℃甘油管中取 1 mL 菌液，接种至 50 mL 预还原 RCM 液体培养基，置于三气培养箱中 30℃静置复苏 2 h。

种子液制备：取 10 mL 复苏菌液接种至 100 mL 种子液培养基，30℃、120 r/min 振荡培养 12 h，至 OD₆₀₀=0.8–1.0。

规模化培养：将种子液按 5% 接种量接入 1 L 发酵培养基，置于三气培养箱中 30℃、150 r/min 振荡培养 48 h，每 12 h 取样检测活菌数与抑菌活性。

3、对照实验设置

以传统厌氧罐培养为对照，采用相同培养基与接种条件，在 30℃下培养 48 h，比较两组生防菌的活菌数、生长曲线及抑菌圈直径。

4、指标测定

活菌数：采用平板涂布法计数，计算 CFU/mL。

生长曲线：分光光度计测定 OD₆₀₀值，绘制生长曲线。

抑菌活性：采用对峙培养法，以青枯雷尔氏菌Ralstonia pseudosolanacearum为指示菌，测量抑菌圈直径。

代谢物检测：高效液相色谱（HPLC）检测发酵液中抗菌代谢物（如有机酸、几丁质酶）含量。

二、结果与分析

（一）三气培养箱对厌氧生防菌生长的影响

博清生物三气培养箱培养的Clostridium beijerinckii与Bacillus velezensis生长速率显著高于厌氧罐对照组。培养 48 h 后，三气培养箱组生防菌活菌数达1.2×10¹⁰ CFU/mL，较对照组（6.5×10⁹ CFU/mL）提升84.6%（P<0.05）。生长曲线显示，三气培养箱组生防菌稳定期活菌数更高，生长平台期持续时间延长，利于代谢产物积累。

（二）三气培养箱对厌氧生防菌抑菌活性的提升

抑菌实验结果表明，三气培养箱培养的生防菌发酵液对青枯雷尔氏菌的抑菌圈直径为22.5 mm，较对照组（17.6 mm）扩大27.8%（P<0.05）。代谢物检测显示，三气培养箱组发酵液中几丁质酶含量为 12.3 U/mL，较对照组提高65.2%；有机酸（乙酸、丙酸）总量达 8.7 g/L，较对照组提升52.6%。

（三）三气培养箱培养的稳定性与重复性

连续 3 批次培养实验显示，三气培养箱组生防菌活菌数变异系数为3.2%，显著低于对照组（8.7%），表明其培养过程稳定性高，批次间差异小，适合工业化规模化生产。

（四）三气培养箱关键技术参数优化

通过单因素实验，确定厌氧生防菌最佳培养参数为：O₂≤0.5%、CO₂ 8%、温度 30℃、湿度 95%、接种量 5%、振荡频率 150 r/min。在此条件下，生防菌活菌数与抑菌活性均达到最优水平，为标准化培养提供了依据。

三、讨论

（一）三气培养箱在厌氧生防菌培养中的核心优势

厌氧生防菌的氧敏感性是制约其培养效率的关键因素，传统厌氧罐依赖化学产气剂消耗氧气，存在气体置换不彻底、氧浓度波动大（常达 1%–3%）等问题，导致厌氧菌活性受损。博清生物三气培养箱采用高精度气体传感器与智能控制系统，可将 O₂浓度精准控制在 0.1%–1% 范围内，且箱内温度均匀性 ±0.2℃、湿度 95%–98%，为厌氧生防菌提供了稳定、无菌的生长环境。

本研究中，三气培养箱组生防菌活菌数较对照组提升 84.6%，抑菌圈直径扩大 27.8%，主要得益于以下机制：

1、精准氧调控：低氧环境（O₂≤0.5%）避免了氧对厌氧菌的氧化损伤，维持了细胞代谢活性，促进菌体增殖。

2、CO₂协同作用：5%–10% CO₂可刺激生防菌（如芽孢杆菌）产生抗菌代谢物，增强抑菌能力。

3、无菌与防污染：304 不锈钢内胆半圆角设计，无清洁死角，配合 HEPA 高效过滤系统，有效减少杂菌污染，保障生防菌纯度。

4、快速恢复能力：箱门开启时空气循环风扇自动停止，减少气体流失与外界空气进入，关门后可快速恢复厌氧环境，降低操作对菌体的影响。

（二）农业应用前景

厌氧生防菌是农业绿色防控的重要资源，其规模化生产是田间应用的前提。本研究建立的基于博清生物三气培养箱的厌氧生防菌培养体系，可实现活菌数≥10¹⁰ CFU/mL，满足生防菌剂生产标准。该体系不仅适用于实验室菌株筛选与优化，还可扩展至工业化发酵生产，为农业生防菌剂的标准化、规模化提供了技术支撑。

博清生物科技（南京）有限公司研发的三气培养箱通过精准控制 O₂、CO₂、N₂浓度，结合恒温恒湿与无菌环境，显著提升了厌氧生防菌的活菌数与抑菌活性。实验证明，在 O₂≤0.5%、CO₂ 8%、30℃、95% 湿度条件下，生防菌活菌数达 1.2×10¹⁰ CFU/mL，抑菌圈直径较传统厌氧罐扩大 27.8%，且批次稳定性高，操作简便高效。该设备为厌氧生防菌的标准化培养与农业规模化应用提供了可靠的技术平台，对推动绿色农业发展具有重要意义。